Le contexte :
Le plateau commun qPCR à Haut Débit de la plateforme MGX est une structure commune aux différentes composantes en biologie de l’Université de Montpellier. Il propose les équipements et compétences nécessaires aux analyses moyen-haut débit par PCR en temps réel : PCR quantitative, génotypage en point final ou par analyse de courbe de fusion, analyse d’expression génique. Il offre également des outils de pipetage de haute précision autorisant une miniaturisation des essais et une réduction drastique des coûts d’analyse. Avec le soutien du Labex CEMEB et du GIS IBiSA, il vient de faire l'acquisition d'un appareil dPCR. Complémentaire à la qPCR, la dPCR permet de dépasser les limites de cette dernière, à savoir : quantification absolue impossible si l’on ne possède pas d’acide nucléique de référence, détection de SNP difficile en cas de déséquilibre allélique < 5 %, résolution de CNV limitée à 2 copies contre 3 copies, sensibilité aux inhibiteurs contenus dans les échantillons environnementaux.
L'équipement :
Ce système de PCR digitale en émulsion (ddPCR) est le Naica fabriqué par la société française Stilla Technologies (https://www.stillatechnologies.com). Son utilisation sera ouverte à toutes et tous, régie par les règles en vigueur sur le plateau. Brièvement, les échantillons (jusqu'à 12 par analyse) sont chargés dans une puce Sapphire, puis placés dans la géode Naica. Cet appareil fractionne l'échantillon en un tableau de gouttes de 0,59nL en 2 dimensions (appelé un "cristal") de 30 000 gouttes. En dPCR, l'échantillon est partitionné de sorte à ce que les molécules d'acide nucléique individuelles de l'échantillon soient localisés et isolées dans des gouttes différentes. Chaque goutte ne contient qu'au maximum une molécule d'acide nucléique. La réaction de PCR est ensuite réalisée directement dans chaque goutte. En fin de cycles PCR, le chip est transféré dans un lecteur permettant de mesurer la fluorescence de chaque goutte/droplet. Jusqu'à 3 canaux peuvent être utilisés. Lorsqu'une molécule d'acide nucléique à amplifier est contenue dans un droplet, celui-ci est positif.
Applications :
- Quantification absolue [1,2,3], en particulier sur des échantillons environnementaux contenant de très faibles quantités d’acides nucléiques et pour lesquels on ne dispose pas d’ADN ou d’ARN de référence.
- Préparation de banques NGS [1,7] : la dPCR permet de quantifier de façon fiable les banques destinées au séquençage haut débit, voire même de contrôler la taille des fragments contenus dans ces banques, permettant ainsi d’optimiser la procédure de préparation.
- Génotypage [4,5]:
- Détection d’allèles rares / individus rares : le partitionnement de l’échantillon en réacteurs de quelques nanolitres permet d’isoler des molécules uniques et de les amplifier sans compétition, permettant ainsi la détection d’individus ou d’allèles rares (1/20000) dans une population et de les faire ainsi ‘sortir du bruit de fond’. Ceci permet d’atteindre une sensibilité inégalable en e-barcoding ou dans la détection des mutations somatiques.
- Résolution des CNV [6]: en qPCR classique, pour distinguer la présence de 4 copies versus 5 copies, il faut 456 réplications du même échantillon ; en dPCR, l’échantillon fractionné en 20k partitions résout plus facilement le même CNV.
Références:
1) White RA et al (2009). Digital PCR provides sensitive and absolute calibration for high throughput sequencing. BMC Genomics 10:116.
2) Tadmor AD (2011). Probing individual environmental bacteria for viruses by using microfluidic digital PCR. Science 333: 58 – 62.
3) Majumdar N et al (2015). Digital PCR Modeling for Maximal Sensitivity, Dynamic Range and Measurement Precision. PloSONE 10(3): e0118833.
4) Deniz Pekin et al (2011). Quantitative and sensitive detection of rare mutations using droplet-based microfluidics. Lab Chip 11, 2156
5) Coren A. Milbury et al (2014). Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular Detection and Quantification 1:8–22.
6) Suzanne Weaver et al (2010). Taking qPCR to a higher level: Analysis of CNV reveals the power of high throughput qPCR to enhance quantitative resolution. Methods 50: 271–276.
7) Dirk S Paul et al (2014). Assessment of RainDrop BS-seq as a method for large-scale, targeted bisulfite sequencing. Epigenetics 9:5, 678–684.
Contacts :
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