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Le contexte : 

En 2013, grâce à un financement européen ERC de l’équipe de Nicolas Tricaud « Mécanismes Moléculaires de la myélinisation / démyélinisation » l’INM s’est équipé d’un microscope multiphoton ZEISS LSM 7 MP OPO. Dans un premier temps utilisé pour répondre aux besoins de l’imagerie dynamique in vivo, cet équipement a ensuite ouvert la voie aux techniques d’imagerie non linéaires et sans marquage SHG et THG. En collaboration avec Hervé Rigneault (Institut Fresnel, Université Aix-Marseille) et Fabrice Bardin (Université de Nîmes & IES Montpellier), la technique d’imagerie sans marquage CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) a été adaptée par Vasyl Mytskaniuk sur ce microscope. Ce développement, abouti en juin 2015, a fait l’objet d’un article scientifique dans la revue JoVe (Mytskaniuk et al. 2016). Depuis la fin du projet ERC, cet équipement est accessible à la communauté sur le plateau d'imagerie de l'INM (plateforme MRI).

 

L'équipements et la technologie :

Le microscope :

Le dispositif est installé sur un statif de microscope droit Zeiss AxioExaminer. Le système est équipé d’un laser pulsé Chameleon Ultra II de la société Coherent (gamme de longueur d’onde entre 680 et 1080nm). Il est couplé à dispositif Chameleon Compact OPO (Optical Parametric Oscillator) de Coherent ce qui permet d'étendre la gamme de longueur d’onde disponible entre 1000 et 1300nm. L'appareil est équipé de 4 détecteurs non-déscannés : 2 photomultiplicateurs "classiques" et 2 photomultiplicateurs à photocathode GaAsP (BiG), permettant le comptage de photons. Une enceinte thermostatée permet de contrôler les conditions environnementales.

La technologie

La microscopie CARS est une méthode d'imagerie dont le contraste de l’image est généré par l'excitation résonante sélective de vibrations moléculaires intrinsèques d'une liaison ou d'un ensemble de liaisons chimiques. C’est un processus optique non linéaire dans lequel trois faisceaux lasers interagissent avec la matière: un faisceau d’excitation « pompe » de fréquence ωpump, un faisceau d’excitation « Stokes » de fréquence ωStokes et un faisceau sonde ωprobe (étant le plus souvent le même que le faisceau « pompe »). Ces trois faisceaux interagissent avec les atomes d’une molécule pour former un signal appelé anti-Stokes (ωCARS ou ωAS sur le schéma ci-dessous, avec ωCARS=ωprobe+ωpump-ωStokes). Ce signal est considérablement amplifié lorsque la différence de fréquence entre les ondes des faisceaux « pompe » et « Stokes » correspond à la vibration moléculaire ωvib = (ωp - ωS). 

Le CARS est un processus multiphotonique qui nécessite l'utilisation de lasers impulsionnels dont les faisceaux sont synchronisés spatialement et temporellement. L’émission du signal anti-stokes ne se produit qu'au point focal d'un objectif de microscope. Dans notre cas nous avons utilisé deux raies lasers infra rouge à impulsions femtosecondes obtenues par un laser Titane : Saphire couplé à un OPO qui duplique le faisceau. L’alignement XYZ des faisceaux est rendu possible par le couplage d’origine du LSM 7 MP OPO et la synchronisation temporelle a été mise en place comme décrit dans Mytskaniuk et al. 2016.

  Applications

Cette technologie de pointe permet de visualiser en temps réel et sans marquage les molécules présentes dans l’échantillon, qui interagissent avec la combinaison de photons produits pas les différents faisceaux lasers. Elle est compatible avec l’imagerie intravitale dans la limite des intensités de laser nécessaires pour imager les molécules d’intérêt. Elle est donc particulièrement intéressante lorsque l’imagerie intravitale ne permet pas le marquage ou lorsque ce marquage du tissu est difficile ou impossible.

La technologie est particulièrement performante pour détecter les liaisons CH2/CH3 qui sont très nombreuses dans les lipides. Il est donc aisé d’imager les lipides lorsque ceux-ci sont abondants comme dans la myéline qui entoure les axones ou dans les adipocytes. Cette technique permet en particulier d’observer et quantifier la dégénération et la régénération de la gaine de myéline in vivo chez la souris et le rat.

Imagerie CARS de la myéline du nerf sciatique de souris lors du processus de démyélintaion et remyélination suite à un écrasement du nerf (crush). La même souris est observée à différents jours suivant l'écrasement (dpc) (figure 3 de Hajjar et al. 2018)

L'imagerie CARS, en modulant la fréquence des faisceaux de pompe, de stokes et de sonde, permet d'imager différentes molécules

L'imagerie CARS est complémentaire de l'imagerie SHG et THG (second harmonic generation et third harmonic generation), deux autres modes d'imagerie sans marquage des molécules. Ces processus non-linéaires se traduisent par la combinaison de l'énergie de 2 (SHG) ou 3 (THG) photons incidents pour générer un photon d'énergie équivalente dont la longueur d'onde est la moitié (SHG) ou le tiers (THG) de celle des photons incidents. De par ses propriétés, l'imagerie SHG met en évidence des structures non-centrosymétriques, comme par exemple le collagène. La microscopie THG permet quant à elle l'imagerie de discontinuités d'indice de réfraction et de l'hémoglobine. La combinaison de ces imagerie sans marquage, de la microscopie de fluorescence est adaptable à de très nombreux échantillons, dont la figure ci-dessous montre quelques exemples.

Contacts :

Cette adresse e-mail est protégée contre les robots spammeurs. Vous devez activer le JavaScript pour la visualiser. (04.99.63.60.79) &Cette adresse e-mail est protégée contre les robots spammeurs. Vous devez activer le JavaScript pour la visualiser. (04.99.63.60.71)

 

Références

  • Mytskaniuk, Vasyl et al. Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) system on a 2 Ti:Sapphire and OPO laser based commercial laser scanning microscope » J Vis Exp. 2016 Jul 17;(113). doi: 10.3791/54262).60-869
  • Hajjar, Boukhaddaoui et al. Label-free non-linear microscopy to measure myelin outcome in a rodent model of Charcot-Marie-Tooth diseases. J Biophotonics. 2018 Dec;11(12):e201800186. doi: 10.1002/jbio.201800186.

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