Le contexte :
Le plateau de génomique MGX du campus Arnaud de Villeneuve propose depuis 2008 des prestations de séquençage à haut débit (NGS). Les applications incluent le séquençage de génome complet ou ciblés (e.g. exome), la transcriptomique, la détermination de l’architecture chromatinienne et l’épigénomique, le génotypage de populations… Financé par un projet Plan Cancer/ITMO Cancer porté par l'IGH et les fonds propres de cette unité, le plateau dispose maintenant d’un appareil permettant de faire du RNA-seq sur cellules uniques en émulsion (Drop-seq).
L'équipement :
L’équipement retenu est le Chromium de la société 10X Genomics. Cet appareil comporte un système microfluidique permettant de générer une émulsion de gouttelettes aqueuses dans de l’huile. Les gouttelettes renferment une cellule, une bille d’hydrogel et des réactifs pour réaliser la transcription inverse des ARN. Après chauffage modéré, la cellule est lysée et la bille d’hydrogel libère des oligonucléotides oligo-dT qui vont permettre la synthèse des ADNc à partir des ARN polyadénylés. Les oligonucléotides comportent également un code-barres spécifique de chaque bille et donc de chaque cellule. L’émulsion est ensuite détruite et une banque RNAseq classique est construite pour chaque échantillon (= 1 pool de cellules). Ces banques sont ensuite séquencées assez profondément (50-400 M de séquences par pool de cellules). Le système permet d’analyser de 500 à 10.000 cellules par échantillon en une seule expérience. Les cellules peuvent être fraiches ou avoir été congelées préalablement. Le nombre de gènes quantifiés par cellule dépend de la profondeur de séquençage, typiquement entre 1.000 et 4.000.
Applications :
Le RNAseq sur cellules uniques (scRNAseq) permet d’identifier, sur la base de leur patron d’expression génique, les différents types cellulaires présents dans une suspension cellulaire. Il permet également d’identifier des marqueurs spécifiques de chaque sous-population. De manière générale, il permet d’identifier les gènes différentiellement exprimés entre une sous-population donnée et le reste de la population ou entre 2 sous-populations. Les domaines d’application incluent tous les domaines de la biologie : immunologie, neurosciences, développement, cancérologie, physiologie, biologie végétale, microbiologie…
(Légende de la figure ci-dessus) Analyse d’un modèle de corticogénèse in vitro. Des cellules souches embryonnaires de souris sont différenciées en progéniteurs neuraux, neurones et cellules gliales. Les banques scRNAseq sont préparées à jour 0 (ESC), jour 12 (progéniteurs neuraux), jour 21 (cellules différenciées précoces) et jour 28 (cellules différenciées tardives). L’algorithme de classification non supervisée suggère la présence de 11 sous-populations (panneau supérieur) caractérisées par les patrons d’expression des gènes indiqués sur la carte thermique (panneau inférieur).
Analyse d’un modèle de corticogénèse in vitro. Des cellules souches embryonnaires de souris sont différenciées en progéniteurs neuraux, neurones et cellules gliales. Les banques scRNAseq sont préparées à jour 0 (ESC), jour 12 (progéniteurs neuraux), jour 21 (cellules différenciées précoces) et jour 28 (cellules différenciées tardives). L’algorithme de classification non supervisée suggère la présence de 11 sous-populations (panneau supérieur) caractérisées par les patrons d’expression des gènes indiqués sur la carte thermique (panneau inférieur).
