Le contexte

Le microscope corrélatif Atomic Force Microscopy (AFM)/direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM) est installé dans les locaux du CBS et fait partie de la plateforme PIBBS. La partie optique a été construite en étroite collaboration entre les équipes de Pierre-Emmanuel Milhiet et Marcelo Nollmann. La partie AFM est un setup commercialisé par JPK/ NanoBruker Nanowizard 3). Ce setup a été financé par le GIS IBISA et par les fonds propres du CBS.

  Le microscope

La partie optique permet de faire de la microscopie de fluorescence en mode épifluorescence, HILO ou TIRF et de la microscopie super résolue PALM ou STORM. Elle est équipée de 4 lasers (405 nm, 488 nm, 560nm, 641nm), et d’une caméra EMCCD Andor iXON Ultra897. La partie AFM est constituée d’une tête et d’un contrôleur JPK. La configuration actuelle de l'AFM permet de faire de l’imagerie haute vitesse (module FastScan) et des mesures mécaniques (module CellHesion) sur des échantillons biologiques, en milieu liquide.

Applications

• L’AFM est une microscopie à sonde locale : le déplacement contrôlé à la surface de l’échantillon d’une pointe nanométrique couplée à un levier souple permet de mesurer les forces d’interaction entre l’échantillon et la pointe. Le contrôle très précis de la position de la pointe et de la force d’interaction entre la pointe et l’échantillon renseignent sur la topographie et les propriétés mécaniques de l’échantillon (Figure 2). Le microscope JPK est implémenté avec un mode d’imagerie quantitative (QI). Avec ce mode, une courbe force-distance est réalisée pour chaque pixel de l’image (Figure 2); ceci permet d’obtenir simultanément la topographie et les propriétés mécaniques en chaque point de l’échantillon.

Les applications de l'AFM sont :

• Mesure de topographie d’échantillons biologiques avec une résolution latérale de l’ordre du nanomètre (une vingtaine de nanomètres pour des cellules) et une résolution axiale subnanométrique (figure 3).

• Mesure de propriétés mécaniques locales: viscosité, élasticité, tension membranaire (voir Figure 4) d’un échantillon biologique.

• esure de forces d’adhésion cellulaires. Dans ces conditions expérimentales, il est possible d'observer la pointe et la région analysée par le côté avec le microscope inversé en utilisant un porte-pointe adapté (side-view cantilever holder JPK, figure 5).

  Figure 5. Mode opératoire pour mesurer des forces d’adhésion cellulaires. Une cellule vivante est immobilisée sur un levier d’AFM sans pointe. (1) La cellule est approchée d’une cellule ensemencée sur un substrat approprié. (2) Lorsque le contact est établi, le levier est maintenu en position le temps que les adhésions cellulaires se forment. (3) Le levier est alors éloigné du tapis cellulaire. Chaque rupture de complexe d’adhésion est visualisée par un décrochement dans la courbe de force / distance. (4) Le levier est complétement rétracté. (Crédit image : JPK NanoBruker)

• Le dSTORM fait partie des Microscopies de Localisation de Molécules Uniques ou SMLM (Single Molecule Localization Microscopy) et permet de reconstruire des cartes de localisation de molécules fluorescentes avec une résolution latérale de l’ordre de la vingtaine de nanomètres.

La combinaison de ces deux technologies permet donc de corréler la topographie d’un échantillon (par AFM) avec sa composition (grâce à la fluorescence). Les résolutions latérales comparables des deux techniques rendent ce setup corrélatif particulièrement puissant pour explorer les relations structure-fonction de complexes macromoléculaires dans des échantillons biologiques.

  Exemple : Réorganisation de la membrane plasmique lors du bourgeonnement du virus VIH-1 dans un modèle cellulaire.

Lors des étapes de bourgeonnement, le virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1) recrute des facteurs de la cellule hôte. Parmi ces facteurs, il semble que certaines tétraspanines puissent jouer un rôle important dans l’infection par le VIH. Les tétraspanines sont une famille de protéines de la membrane plasmique qui peuvent s'organiser en domaines membranaires enrichis en lipides et protéines spécifiques. Nous avons étudié par dSTORM l’organisation des tétraspanines CD9 et CD81 dans un modèle cellulaire d’infection par VIH-1 (cellules HeLa transfectées par Gag). La corrélation de ces données avec la topographie membranaire obtenue par AFM a permis de montrer des changements importants dans la distribution latérale des tétraspanines induits par Gag (figure 6).  Ceci s’accompagne d’une importante déplétion de CD9 et CD81, probablement due à l’excision des domaines membranaires où les tétraspanines sont concentrées.

Cette adresse e-mail est protégée contre les robots spammeurs. Vous devez activer le JavaScript pour la visualiser. (responsable plateau AFM, 04 67 41 79 17)