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La plateforme de peignage moléculaire MDC (Montpellier DNA Combing) existe depuis 2012. Elle se positionne en expert de la technique de peignage moléculaire et a contribué à de nombreux travaux scientifiques à travers le monde. Le peignage moléculaire de l’ADN est une méthode biophysique développée à l’Ecole Normale Supérieure de Paris puis à l’Institut Pasteur (Bensimon et al., 1994; Michalet et al., 1997) permettant d’aligner avec un facteur d’étirement constant (~2 kb/µm) de longues molécules d’ADN (jusqu’à 5 Mb) sur des lamelles de verre silanisées.
Cette technique fournit une méthode quantitative pour suivre l’activation et la progression des fourches de réplication à l’échelle de la molécule individuelle, après incorporation in vivo d’analogues de la thymidine dans l’ADN nouvellement synthétisé (Lengronne et al., 2001).
Contrairement aux approches basées sur les populations (Gels 2D, ChIP/ChIP, ChIP/seq…), cette technique prend en compte la nature stochastique de l’activation des origines et révèle la dynamique de réplication au sein de cellules individuelles. Les valeurs obtenues ne sont pas moyennées sur la population et permettent donc de détecter des altérations subtiles de la réplication qui sont invisibles par les autres techniques d’analyse de la réplication.
Appareillage permettant le peignage en simultané de 8 échantillons. La surface de verre est fixée par une pince puis plongée dans la solution d’ADN. Après incubation, la lamelle est remontée à vitesse constante permettant d’étirer l’ADN avec un facteur contrôlé (2kb/µm)
Etirement de pelotes d’ADN sur la surface hydrophobe. Les fibres d’ADN sont ainsi étirées et alignées sur la lamelle de verre silanisée.
Le peignage moléculaire a deux applications principales
- L’analyse de microremaniements chromosomiques (délétions, inversions, duplications de 50 à 500 kb) ;
- L’étude fine de la dynamique de réplication des chromosomes eucaryotes. Pour cette dernière application, les cellules en cours de réplication sont pulsées avec des analogues de la thymidine (IdU, CldU), l’ADN génomique est préparé puis déposé (peigné) sur les lamelles silanisées. L’incorporation des analogues est détectée à l’aide d’anticorps spécifiques couplés à des fluorophores distincts, le long des molécules individuelles d’ADN pouvant atteindre 5 Mb de long (Figure 3).
Différentes étapes depuis le marquage des cellules jusqu’à l’acquisition des images en microscopie et la mesure des paramètres dynamiques de la réplication
Plusieurs paramètres importants pour comprendre les anomalies de la réplication peuvent être obtenus à partir de ces images
- la vitesse individuelle des fourches de réplication (FV)
- l’asymétrie de progression des fourches à droite et gauche des origines (FA)
- les distances inter-origines (IOD)
- la densité globale instantanée en fourches de réplication (GIFD)
Représentation graphique des vitesses de fourches (FV) et des distances inter-origines (IOD)
Ces mesures permettent de détecter l’existence d’un stress réplicatif lié à une diminution des pools de nucléotides ou une inhibition des DNA polymérases (FV réduite), à des dommages à l’ADN (FA élevée), une diminution locale ou générale du licensing ou de l’activation des origines (IOD élevée, GIFD réduite) (Bialic et al., 2015).
Quelques axes en cours de développement sur la plateforme
Nouvelle approche de détection par séquençage électronique sur nanopores des analogues de la thymidine utilisés comme traceurs de la réplication.
Mise au point de la détection de BrdU et/ou EdU par nanopore sequencing
Une récente avancée dans le domaine du séquençage, qui repose sur la détection de courants électriques plutôt que sur la synthèse d'ADN, a été mise sur le marché par la société Oxford Nanopore Technologies. Cette technique permet non seulement de lire des molécules d'ADN extrêmement longues (jusqu'à 800 kb), mais également de repérer des altérations au niveau des bases, telles que celles utilisées comme marqueurs de la réplication (comme le BrdU ou l'EdU). Cette méthode s'ajoute de manière complémentaire à l'approche du peignage moléculaire.
Développement d’un scanner de lame quadri-chrome performant pour imager de grands échantillons biologiques (coupe de tissus, populations cellulaires) à haute résolution spatiale et forte homogénéité
Prototype d’un scanner de lames quadri-chrome en collaboration avec la société privée Biocampus et la plateforme Biocampus MRI
L’objectif est de pouvoir imager en multi-fluorescence des échantillons de plusieurs centimètres de longueur de manière automatique sans perte de focus et à haute résolution/ scan homogène et focalisé en acquisition multi-fluorescence, une résolution spatiale correcte, une vitesse d’acquisition au moins similaire aux scanners actuels et une taille d’images exploitables même pour de très gros échantillons.
Que pouvons nous vous apporter ?
Plusieurs prestations sont possibles :
- La production et la distribution de lamelles silanisées pour les personnes souhaitant réaliser eux-mêmes leurs expériences de peignage moléculaire (service limité aux laboratoires CNRS ou affiliés CNRS, pour cause de propriété intellectuelle).
- L’analyse biologique complète pour toute personne désirant nous confier ses échantillons, du traitement des blocs d’agarose jusqu’à l’analyse des images de peignage et les analyses statistiques.
- L’analyse des images de peignage moléculaire: l’utilisateur nous envoie ses images et nous nous chargeons de mesurer les paramètres de la réplication de son choix (vitesse de fourches, densité globale, asymétries de fourches et distance inter-origine) via notre logiciel d’analyse propriétaire IDeFIx.
- Enfin, de la formation est possible à tout personnel tout aussi bien sur les traitements biologiques que pour l’analyse d’images avec notre logiciel dédié
Tarification actuelle
| Prix HT CNRS | Prix HT Public | Prix HT Privé | |
| Analyses Biologiques (l'analyse) | 600€ | 600€ | 1600€ |
| Lamelles silanisées (la lame) | 4.5€ | - | - |
| Formation (1/2 journée) | 75€ | 75€ | 200€ |
Qui contacter ?
- Le responsable de la plateforme / responsable scientifique: Etienne Schwob au 04.34.35.96.79
- La co-responsable et responsable technique et opérationnelle : Marjorie Drac au 04.34.35.96.31 ou au 04.34.35.96.77
Pour envoyer un mail nominatif au personnel de la plateforme n'hésitez pas à utiliser notre annuaire.
Où nous retrouver ?
La plateforme est située dans les locaux de l’Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier
Adresse postale :
CNRS-UMR 5535
1919 Route de Mende
34293 Montpellier- Cedex 5 - FRANCE
Ils nous ont fait confiance...
Organigramme de le Plateforme MDC
Direction de la plateforme MDC
- Etienne SCHWOB (DR, CNRS, 5%)
Responsable Scientifique :
- Marjorie DRAC (IE, CNRS, 5%)
Responsable opérationnel :
Comité d'orientation scientifique et technique
- Sébastien HOFFMANN (CRCT, Toulouse)
Experts externes :
- Philippe PASERO (IGH, Montpellier)
Experts locaux :
IGMM Peignage moléculaire
- Etienne SCHWOB (DR, CNRS, 15%)
Responsable Scientifique :
- Marjorie DRAC (IE, CNRS, 95%)
Responsable Technique :
