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Le contexte : 

L’acquisition d’images sur des échantillons dont l’épaisseur est bien supérieure à la capacité de pénétration de la lumière et de détection des signaux est difficile du fait de l’absorption et de la diffusion des photons, et passe classiquement par des images sur des coupes sériées ou des objets transparisés. La solution complémentaire proposée par le plateau MRI PHIV-Lavalette (campus CIRAD) est un automate couplant acquisition d’images avec un microscope multiphoton et coupes au vibratome (financement FEDER).

L’acquisition des images se fait à la surface de l’échantillon avec le microscope multiphoton après chaque coupe. La somme des images est traitée pour avoir une visualisation tridimensionnelle de l’échantillon total.

L'équipement :

Un microscope droit multiphoton Zeiss 880 couplé à un vibratome Microm permet d’acquérir des images sur de gros échantillons de plusieurs mm d’épaisseurs (jusqu’à 1 cm3). Il est équipé d’un laser pulsé infrarouge Chameleon Ultra II de chez Coherent (690-1080 nm), d’un détecteur NDD et d’un détecteur spectral. Les images sont obtenues avec un objectif 20x Plan APO NA 1,0 mm plongeant. L’échantillon, enrobé ou non d’agarose, est collé sur une plaque métallique dans un bac rempli d’eau ou de tampon. Les coupes ne sont pas utilisées pour l’acquisition des images et restent dans le bac. L’automate se déplace du vibratome au microscope avec une précision micrométrique. L’épaisseur des coupes au vibratome est réglée en fonction de la capacité de pénétration du laser infrarouge dans le tissu biologique. Par exemple, pour une épaisseur de coupe de 60 µm, l’acquisition en Z se fera à la surface de l’échantillon sur une épaisseur de 100 µm afin d’obtenir des Z-stacks chevauchants et faciliter la fusion des piles d’images et la visualisation en 3D. Le système permet l’automatisation de la séquence acquisition-coupe sur plusieurs heures. Le programme peut être démarré en fin d’après-midi et fonctionner pendant la nuit.

 

 

 

 

 

 

Serial Block Face Imaging : microscope multiphoton couplé à un vibratome, banc d’automatisation

Applications :

L'appareil permet la visualisation de structures cellulaires ou tissulaires (autofluorescence ou colorants) ou de protéines fluorescentes sur de gros échantillons qui peuvent être préalablement transparisés si besoin: racines, tiges, graines, fruits, Zebrafish, cerveau de souris, insectes, etc...

Plantule de Oryza sativa, 1 cm de hauteur et 2 mm de largeur, 30 coupes de 60 µm au niveau du collet

Zebrafish : visualisation de l’aorte sur embryon (GFP, YFP), 50 coupes de 30 µm. Nausicaa Poullet/Karima Kissa (DIMNP, Montpellier)

Contacts :

N'hésitez pas à prendre contact avec Cette adresse e-mail est protégée contre les robots spammeurs. Vous devez activer le JavaScript pour la visualiser. & Cette adresse e-mail est protégée contre les robots spammeurs. Vous devez activer le JavaScript pour la visualiser. (plateau MRI-PHIV-Lavalette, avenue Agropolis, CIRAD) afin de connaitre les conditions de préparations des échantillons et d’utilisation de l’automate.

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